谷胱甘肽-琼脂糖凝胶 4B（GST 标签纯化树脂）说明书
货号：P2020
规格：5ml/10ml
保存：4℃保存，有效期至少一年
产品简介：
pGEX载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。
GSTs 是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子的酶。由
于GST 对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST 及其融合
蛋白的纯化效率很高。可以用含游离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST 融合蛋白。树脂用3mol/L NaCl 的缓冲
液再生。
谷胱甘肽琼脂糖对GST 融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能结合8 毫克融合蛋白）。
特性:
粒度：45-165um 流速：75cm/h
工作PH:4-10 耐压:0.3Mpa
载量:＞5mg 谷胱甘肽 S-转移酶
使⽤说明：
谷胱甘肽树脂的处理:
1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器，将树脂混成匀浆。
2.取部分匀浆放入15ml 聚丙烯管（每100ml 细菌培养物大约需要2ml 匀浆）。
3.4℃ 500 g 离心5 分钟，小心去掉上清。
4.在树脂中加入10 倍柱床体积预冷的PBS，颠倒数次混匀，4℃ 500 g 离心5 分钟，小心去掉上清。
5.每毫升树脂加入1 毫升冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒数次，混合均匀，悬液冰上放置待用。
制备细胞抽提物：
6.每100 毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mlPBS 缓冲液中。
7.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml,冰上放置30 分钟。
8.用针筒将10ml 浓度为0.2%的TritonX-100 强行注入黏稠的细胞裂解物中，剧烈振动数次混匀。加入
DNase 和RNase 至终浓度5ug/ml, 4℃振动温育10 分钟，4℃ 3000 g 离心30 分钟，去除不溶性细胞碎片，上
清转移到一只新管中，加入DTT 至终浓度1mmol/L。
纯化融合蛋白：
9.细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，每100 毫升细菌培养物加2ml 树脂，于室温轻
摇30min。
10.混合物于4℃以500 g 离心5 分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
11.沉淀中加入10 倍柱床体积的冷的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白。
12.4℃以500 g 离心5 分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳。
13.重复步骤11 和12 两次。
14.结合的GST 融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱液洗脱，也可用凝血酶、肠激酶或Xa 因子切割，释放靶蛋白。
用谷胱甘肽洗脱融合蛋白：
a.沉淀中加入1 倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min，洗脱树脂上结合的蛋白。
b. 4℃以500 g 离心5 分钟，上清（含洗脱的融合蛋白）移至新管中。
c.重复步骤a 和b 两次，合并3 次上清。
蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：
a. 在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择），每ml
树脂加入50 单位溶于1mlPBS 的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2—16 小时。用小规模实验确定
精确时间。
b.4℃以500 g 离心5 分钟，上清小心移至新管中。（GST 仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中，蛋白酶也
在上清中，仍需要分离）
15.10% SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析每一步样品的蛋白质组成。
试剂配制：
谷胱甘肽洗脱缓冲液：10mmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)
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