文章导读
环状RNA (circRNA)作为新型非编码RNA,具有比线性RNA更加稳定的环状结构，可通过多种机制调控靶基因。近年来，circRNA被发现在多种肿瘤组织和细胞中异常表达，作为肿瘤的诊断生物标志物或治疗靶点，具有巨大的价值，受到广泛的关注。癌症新的证据表明，circRNAs在癌症的发生发展中起着重要的调控作用。云序用户山东大学刘志方课题组近期在Molecular Cancer杂志上发表的文章，通过全转录组测序、分子实验和细胞动物表型实验探讨了hsa_circ_0004872在胃癌（GC）中的作用及其调控机制。

发表杂志：Molecular Cancer
影响因子：15.302
发表时间：2020.11.10
技术方法：全转录组测序、RIP-qPCR、pull down、双荧光素酶实验、ChIP
文章链接：Circular RNA hsa_circ_0004872 inhibits gastric cancer progression via the miR-224/Smad4/ADAR1 successive regulatory circuit

1. 高通量测序筛选发现hsa_circ_0004872在GC中下调
作者通过对全转录组测序进行circRNA分析，筛选出4个在GC中差异表达的circRNA，通过在42对组织样品中进行qPCR验证筛选出差异最显著的hsa_circ_0004872，并通过sanger测序验证了反式剪切位点处序列。作者还进一步扩大样品量，在34对组织样品中qPCR验证了hsa_circ_0004872的差异表达，并通过酶耐受实验验证了该环状的稳定性。

2. 细胞实验验证过表达hsa_circ_0004872抑制GC细胞增殖、侵袭和迁移
在GC细胞中通过构建的质粒过表达hsa_circ_0004872发现抑制了细胞的增殖、侵袭和迁移。而通过siRNA敲降hsa_circ_0004872则增加了细胞增侵袭和迁移。

3. hsa_circ_0004872作为分子海绵吸附miR-224
作者首先通过FISH实验观测到hsa_circ_0004872主要分布在细胞质。然后通过RIP-qPCR验证到hsa_circ_0004872与AGO2蛋白结合，pull down实验显示hsa_circ_0004872与miR-224结合。qPCR显示敲降和过表达hsa_circ_0004872可以影响miR-224转录本水平，并且在GC组中miR-224也检测到差异表达。双荧光素酶实验也证实了miR-224可以与hsa_circ_0004872结合。

4. miR-224通过靶向p21和Smad4促进GC细胞增殖、侵袭和迁移
验证了hsa_circ_0004872结合并调控miR-224后，作者接下来验证了miR-224对细胞的影响。EdU和CCK-8实验证实了miR-224促进GC细胞增殖。划痕伤口愈合实验和transwell实验证实了miR-224促进GC细胞侵袭和迁移。对miR-224下游靶基因的研究发现，miR-224可抑制p21 和Smad4基因的转录本和蛋白水平。双荧光素酶实验进一步验证到miR-224结合p21 和Smad4的3’-UTR区。最后，敲降hsa_circ_0004872后验证到了p21 和Smad4的表达受到抑制。

5. 回补实验证明hsa_circ_0004872通过 miR-224产生抑癌作用
作者在过表达hsa_circ_0004872的细胞中转入miR-224，发现可终止hsa_circ_0004872对细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用，同时也会使原本升高的Smad4和p21表达降低。

 

6. 体内实验验证hsa_circ_0004872抑制肿瘤发生和转移
通过皮下注射过表达hsa_circ_0004872的BGC-823细胞和对照组BGC-823细胞发现，过表达hsa_circ_0004872组生成的肿瘤明显小于对照组，并且肿瘤中Smad4和p21表达升高。尾静脉注射实验也发现过表达hsa_circ_0004872组肺表面形成的转移性结节明显要小于对照组。这些结果表明，hsa_circ_0004872能够抑制肿瘤的发生和转移。

 
7. hsa_circ_0004872受RNA编辑蛋白ADAR1调控
为了寻找调控hsa_circ_0004872的因素，作者通过对数据库中GC样品中基因表达情况进行分析发现RNA结合蛋白ADAR1在GC组中经常显著上升，并通过qPCR进行了验证。同时数据分析也显示GC 组织中ADAR1蛋白的高表达与短生存周期相关。于是，作者在GC细胞中敲降和过表达ADAR1，发现敲降ADAR1后hsa_circ_0004872表达上升，miR-224表达水平降低；而过表达ADAR1，hsa_circ_0004872表达降低并且miR-224水平上升。这些结果表明ADAR1可以通过hsa_circ_0004872调控miR-224。

8. Smad4通过ADAR1调控hsa_circ_0004872
最后，有趣的是，hsa_circ_0004872通过miR-224调控的靶基因Smad4是一个转录因子，作者通过ChIP-PCR实验和双荧光素酶实验验证到了Smad4可以结合ADAR1的启动子区，并且在GC细胞过表达Smad4会降低ADAR1的mRNA和蛋白水平。对数据库中GC组织样品的生信分析显示ADAR1的表达与Smad4的表达负相关，并且Smad4的低表达与短生存周期相关。

总结
本研究通过全转录组测序筛选出在GC组织中下调的hsa_circ_0004872，通过RIP-qPCR、pull down、和双荧光素酶实验验证了其通过海绵机制吸附miR-224从而调控下游靶基因p21 和Smad4，产生抑癌作用。并且通过ChIP实验和双荧光素酶实验验证了转录因子Smad4又通过调控RNA结合蛋白ADAR1调控hsa_circ_0004872形成一个反馈回路。

云序生物环状RNA研究优势
云序生物作为国内早期提供环状RNA测序的测序公司，自行建立的环状RNA数据库circDB，凭借物种覆盖广、数据量大、疾病背景多的特点为客户提供优质的服务。云序积累了超过10000例环状RNA测序的经验，样本覆盖20多个物种以及50多种疾病。云序生物提供系统性环状RNA服务，从筛选（circRNA测序）到验证（qPCR）再到机制研究（RIP、RNA pull-down、ChIP）以及上游表观调控（m6A甲基化等各类RNA修饰研究），全方位的覆盖环状RNA上下游分子机制验证的重要研究环节。除了提供组织和细胞的样本类型测序之外，我们还提供体液、血清血浆、外泌体石蜡样本等特殊样本的测序服务。
 
云序环状RNA课题技术服务四大模块
一、 环状RNA筛选：
1.1 circRNA测序
1.2 全转录组测序
同时检测circRNA、lncRNA、mRNA
二、环状RNA验证
2.1 qRT-PCR
对选定目标RNA分子可进行qPCR检测服务，包括引物设计与表达鉴定。
2.2 Sanger测序与RNase R酶耐受实验
对选定的环状RNA分子进行反式剪切位点引物设计，扩增后Sanger测序验证环状；使用RNase R酶处理环状RNA分子，验证环状RNA分子稳定性。
三、 CircRNA功能机制研究
3.1 RIP测序/RIP-qPCR
针对目标蛋白抗体把蛋白-RNA复合物沉淀下来，并对复合物上的RNA进行测序或对目标RNA进行qRCR表达分析。
3.2 RNA pull-down+MS/WB/qPCR/RNA-Seq
设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，蛋白质谱检测或WB检测与RNA结合的蛋白。设计目标RNA生物探针把相应的结合蛋白质与RNA复合物沉淀下来，qPCR检测或RNA-seq检测与RNA结合的RNA。
3.3 双荧光素酶报告实验
双荧光素酶报告实验检测两个基因之间的互作。
3.4 ChIP测序/ChIP-PCR
检测转录因子或者组蛋白与下游基因的结合情况。
四、CircRNA修饰研究
4.1 m6A/m5C/ac4C/m7G/m1A等修饰
针对环状RNA各类修饰进行高通量筛选。
4.2 MeRIP-circRNA-PCR验证
对高通量测序的结果，通过qPCR进行进一步验证。
 
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