自噬是近年来国自然的研究热点之一，那么自噬究竟是什么，怎么研究？跟小编一起一探究竟吧！
什么是自噬？
自噬 (autophagy)，是细胞中存在的一种非常关键的实现细胞本身代谢需要和某些细胞器的更新的机制。在饥饿、能量缺乏等代谢应激条件下，细胞为了自救，会通过自噬来获得新的能量来源和物质需求以维持细胞稳态。
自噬的分类
根据细胞物质运到溶酶体内的途径不同，自噬分为以下几种。
01 大自噬（macroautophagy）
由内质网、高尔基体或细胞质膜等来源的膜，包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体（autophagosome），并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物；
02 微自噬（microautophagy）
溶酶体的膜直接包裹待降解物，并在溶酶体内降解；
03 分子伴侣介导的自噬（chaperone mediated autophagy, CMA）
胞质内蛋白结合到分子伴侣后被转运到溶酶体中，然后被溶酶体酶消化。
CMA 的底物是可溶的蛋白质分子，在清除蛋白质时有选择性，而前两者无明显的选择性。
自噬研究价值？
自噬在机体的生理和病理过程中都能见到，自噬还参与多种疾病的发生和发展。有研究发现，在肿瘤发展的早期，自噬通过减少细胞内的过氧化物来维持细胞内环境的稳定，抑制肿瘤形成。如果自噬功能降低或紊乱，会引发一系列的疾病；大量研究表明，自噬功能障碍与衰老、肿瘤、神经退行性疾病、心脑血管病、代谢糖尿病和自身免疫疾病的发生发展密不可分。
因此自噬在疾病治疗方面有很大的应用前景，可以通过控制自噬过程，来有效清除有害或受损物质、促进细胞凋亡来治疗疾病。
自噬该如何研究呢？
LC3全称MAP1LC3 ，贯穿整个自噬过程，是目前公认的自噬标记物。
LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸残基，产生胞浆定位的LC3-I。
在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系修饰和加工，与磷脂酰乙醇胺（PE）相偶联，形成LC3-II并定位于自噬体内外膜上。自噬体和溶酶体融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，产生LC3-I循环利用；内膜上的LC3-II被溶酶体酶降解，导致自噬溶酶体中LC3含量很低。因此，可以通过荧光显微镜观察mRFP-GFP-LC3或GFP-LC3，实现对自噬发生的检测。
自噬的检测方法及原理：
1、LC3双荧光标记法
mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系的出现，将自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制，自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。
观察自噬流变化的LC3双荧光标记法，即使用同时带有RFP和GFP的病毒感染细胞。GFP是酸敏感型GFP蛋白，在酸性环境下GFP会淬灭，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。当自噬发生时，可见明亮黄光点，此为被红光和绿光同时标记的自噬体；当自噬体和溶酶体融合，自噬溶酶体内的pH值降低，使得改造过的GFP蛋白荧光淬灭，只可观测到红光。
因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。
吉凯设计的LC3双荧光自噬系统采用绿色荧光蛋白Sens-GFP和红色荧光蛋白Stub-RFP，这两种荧光具有更高的荧光强度，绿色荧光标记Sens-GFP对pH值更为敏感，在自噬溶酶体中淬灭更完全；而且Sens-GFP和Stub-RFP具有更低的细胞毒性，对细胞状态影响更小。
2、GFP-LC3 单荧光自噬指示体系
利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理，开发出GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62来验证。
3、Western Blot检测LC3的切割
利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
4、透射电镜下观察自噬体的形成
自噬经历了三个阶段：吞噬泡(phagophore)--自噬小体(autophagosome)--自噬溶酶体(autolysosome)。
透射电镜下吞噬泡(phagophore)的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬小体(autophagosome)的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(autolysosome)的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。
5、WB检测自噬底物p62
在自噬体形成过程中，p62作为链接LC3和聚泛素化蛋白之间的桥梁，被选择性地包裹进自噬体，之后被自噬溶酶体中的蛋白水解酶将其降解，所以p62蛋白的表达量与自噬活性呈现负相关。因此，利用Western Blot检测p62蛋白的表达量也可以评价自噬水平。
自噬的人工干预和调节
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察。
为了研究自噬，必须对自噬进行人工干预和调节
（一）自噬诱导剂
1）Brefeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
5）Rapamycin：最典型最常用的自噬激动剂(最常用)
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
（二）自噬抑制剂
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）
除了选用上述工具药外，一般还可以结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预。
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