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影响因子：27.401
发表时间：2022年4月9日
研究方法：m6A MeRIP-seq、RNA-seq、MeRIP-qPCR、RIP-qPCR
文章链接：The m6A demethylase ALKBH5 promotes tumor progression by inhibiting RIG-I expression and interferon alpha production through the IKKε/TBK1/IRF3 pathway in head and neck squamous cell carcinoma
技术路线
研究内容
1、在HNSCC中，m6A修饰水平下调和m6A去甲基化酶表达上调与预后不良相关
通过TCGA数据库分析了m6A writers, erasers, and readers (WERs)在HNSCC中的表达，发现AKLBH5在14个WERs中上调最显著，是HNSCC中理想的研究对象。此外， HNSCC组与配对正常组织相比m6A修饰百分比下降，大多数HNSCC细胞系的m6A修饰水平低于初级口腔角质形成细胞。因此作者推测HNSCC中m6A的下调可能与去甲基化酶的过表达有关。使用免疫组化技术进一步检测发现ALKBH5和FTO在HNSCC组织中表达上调，其高表达与HNSCC中TNM晚期和预后不良相关。根据ROC曲线，ALKBH5诊断HNSCC的敏感性为65.7%。5个肿瘤组织中ALKBH5蛋白的表达高于邻近正常口腔上皮组织。这些结果表明，在HNSCC中，m6A去甲基化酶的表达上调可促进低m6A状态，并与不良预后相关。
2、抑制ALKBH5可降低体外细胞增殖和体内肿瘤生长
为了探索ALKBH5在肿瘤发展中的作用，在HN4和Cal27细胞中敲低ALKBH5 ，发现显著降低了细胞增殖和克隆形成。此外，沉默ALKBH5可降低DNA复制活性，且G1期和凋亡细胞的比例也明显增加。基因集富集分析显示这些表达变化的基因与细胞周期和DNA复制过程有关。这些结果表明，ALKBH5是一个驱动HNSCC发展的致癌基因。为了进一步确定ALKBH5在肿瘤生长中的作用，在Cal27细胞系中构建了敲低和过表达模型。敲低ALKBH5可以抑制肿瘤生长，而过表达则促进肿瘤生长。此外，TUNEL染色显示，敲低ALKBH5的表达增加了细胞凋亡，而过表达则降低了细胞凋亡。以上结果表明，ALKBH5在HNSCC的发展中起着非常重要的作用。
3、HNSCC中m6A修饰特征及ALKBH5下游靶点分析
接下来探究ALKBH5促进肿瘤发生的分子机制。首先m6A整体水平检测发现在HNSCC细胞系中，ALKBH5的缺失增加了m6A的总丰度。然后通过m6A MeRIP-seq和RNA-seq，共筛选出171个差异表达和m6A修饰差异基因。motif分析显示，GGACU基序在m6A位点高度富集，与m6A序列RACH一致。总体而言，对照组和ALKBH5缺陷细胞分别鉴定出2080和1962个独有的m6A峰，以及1172和1071个独有的m6A修饰基因。作者进一步研究了m6A的分布模式，在对照组和ALKBH5缺陷细胞中，总m6A峰和两组共有m6A峰分布模式相似。有趣的是，CDS区中m6A的相对增加是以一种依赖于ALKBH5的方式。为了探究ALKBH5沉默后下游的生物学过程，对差异表达基因(DEGs)进行功能富集分析。利用聚类分析方法将DEGs分为凋亡、迁移和免疫三个部分进行分析和分组。GO功能分析显示，DEGs与肿瘤发展过程，如生长的负调控和细胞周期阻滞，以及固有免疫过程，如细胞对I型干扰素和dsRNA的反应相关。
4、ALKBH5通过m6A修饰调控RIG-1的表达
接下来通过qPCR验证DEGs的表达，包括参与细胞对I型干扰素反应的DEGs。ALKBH5敲除后，DDX58的增加最为显著，且在细胞系之间相对一致。火山图显示，与对照相比，DDX58的mRNA表达和m6A修饰水平相对较高。可视化分析显示，在DDX58 mRNA的3'UTR区，m6A显著富集。且MeRIP-qPCR实验证实，在HN4和Cal27细胞系中，ALKBH5敲除后，DDX58 mRNA的m6A修饰显著升高。这些结果表明，DDX58是HNSCC中ALKBH5介导的m6A甲基化修饰靶点。
DDX58编码RIG-I蛋白，RIG-I蛋白是一种识别病毒RNA的细胞质受体，在先天免疫和I型干扰素的产生中起着关键作用。敲除ALKBH5显著增加了RIG-I蛋白表达，说明ALKBH5通过去甲基化活性影响RIG-I的表达。同样，过表达RIG-I可逆转ALKBH5介导的抑制。此外，ALKBH5过表达抑制RIG-I介导的IFNα分泌。为了确定依赖于ALKBH5的m6A调控对RIG-I表达的影响，将m6A共识序列中的两个A突变为C， ALKBH5缺失显著提高了WT型DDX58的荧光素酶活性，而非突变型。并且通过RNA稳定性实验发现，在HNSCC细胞中，敲低ALKBH5可提高DDX58的表达，延长DDX58 mRNA转录本的半衰期。这些结果表明，ALKBH5介导的DDX58 mRNA m6A水平降低可抑制RIG-I的表达。
5、RIG-1的过表达逆转了ALKBH5的致癌基因作用
由于RIG-I是ALKBH5的一个新的下游靶点，因此有必要研究RIG-I在ALKBH5致癌基因中的作用。正如预期的那样，RIG-I的过表达逆转了HN4和Cal27细胞中ALKBH5过表达引起的细胞增殖和细胞群数量的增加。此外，EdU检测显示RIG-I可以降低ALKBH5介导的DNA复制活性。为了进一步支持体外实验结果，作者还制作了小鼠模型。发现过表达ALKBH5增加了肿瘤的大小和重量，并被RIG-I的表达所抑制。此外，回补RIG-I表达可缓解ALKBH5过表达引起的Ki-67指数的升高和TUNEL阳性百分率的降低。这些结果表明，抑制RIG-1表达是HNSCC中ALKBH5介导的肿瘤发生的关键事件。
6、HNRNPC是DDX58 mRNA m6A修饰的“reader”蛋白
为了找到DDX58的“reader”蛋白，并确定DDX58调控的m6A依赖机制，进行了ChIRP-MS实验。共鉴定出109个蛋白，从7个异质性核核糖核蛋白C (HNRNPC)多肽中鉴定出6个独特的多肽，它们具有最高的特异性。此外，western blot分析显示，在ALKBH5沉默后，DDX58探针显著与HNRNPC结合，并增加m6A水平。RIP-qPCR实验显示，HNRNPC抗体与RIG-I结合显著增加了RIG-I的表达。敲除RIG-I后逆转了HNRNPC过表达介导的作用，相反，敲除HNRNPC也会抑制RIG-I的表达。这些结果表明，沉默ALKBH5增加了DDX58 mRNA的m6A修饰以及随后与HNRNPC的结合，促进了DDX58 mRNA的成熟，增强了RIG-I蛋白的表达。
7、由ALKBH5调控的RIG-1通过IKKε/TBK1/IRF3通路影响IFNα的分泌
已有研究报道RIG-1识别病毒RNA，激活IKKε/TBK1/IRF3通路诱导I型干扰素产生。为了探究ALKBH5是否也通过调控RIG-I来影响IFNα的分泌，检测了RIG-I和IFNα产生的下游信号通路。有趣的是， GSEA分析显示，ALKBH5沉默后RIG-1样受体通路和干扰素α/β信号通路显著富集，表明ALKBH5参与了RIG-I信号转导和干扰素的产生。在HNSCC细胞系中，RIG-I过表达后IKKε/TBK1/IRF3磷酸化水平升高，酶联免疫吸附试验显示过表达RIG-I后培养液中IFNα分泌增加。此外，过表达 ALKBH5显著降低了IFNα的分泌，同样，敲低HNRNPC后也降低了IFNα的分泌。为了探索IKKε/TBK1/IRF3通路的作用，使用IKKε/TBK1特异性抑制剂bay985。这种抑制剂降低了ALKBH5敲低后引起的RIG-I表达的上调和IFNα的分泌。
IFNα作为一种免疫调节细胞因子，在自然杀伤细胞(NK)、T细胞、树突状细胞(dc)等免疫细胞的激活中发挥重要作用，并发挥抗肿瘤作用。使用小鼠HNSCC细胞系SCC7在免疫活性C3H/HeJ小鼠体内建立异种移植模型，发现IFNα逆转了ALKBH5过表达介导的促肿瘤能力。过表达ALKBH5后，血清IFNα浓度降低。此外，ALKBH5沉默后，肿瘤浸润淋巴细胞中NK细胞、T细胞、DCs和M1巨噬细胞的百分比显著降低。以上结果表明，HNSCC中过表达ALKBH5可通过调控RIG-I抑制IFNα的分泌，进而抑制免疫浸润，促进肿瘤进展。
8、AKLBH5表达上调与HNSCC中RIG-1和IFNα表达呈负相关
为了研究ALKBH5/ RIG-I/IFNα调控轴的临床相关性，使用组织芯片对138例HNSCC标本进行了免疫组化染色。ALKBH5的表达与RIG-I和IFNα的蛋白水平呈负相关，而RIG-I的表达与IFNα的表达呈正相关。这些结果在临床样本中验证了相关性。综上所述，上调的ALKBH5通过IKKε/TBK1/ IRF3通路抑制RIG-I介导的IFNα分泌，从而在HNSCC中发挥致癌作用，最终减少免疫杀伤细胞浸润，促进肿瘤进展。
总 结
本研究发现了ALKBH5通过IKKε/TBK1/IRF3通路抑制RIG-I表达和干扰素α的产生进而促进肿瘤发生。采用组织芯片技术检测HNSCC中m6A去甲基化酶ALKBH5的表达，利用m6A-MeRIP-seq和RNA-seq鉴定ALKBH5的下游靶点，ChIRP-MS技术寻找m6A“reader”蛋白。在此，作者证实了在HNSCC中m6A修饰下调和两种去甲基化酶上调，沉默去甲基酶ALKBH5会抑制肿瘤进展。此外，ALKBH5下调了DDX58 mRNA的m6A修饰，“reader”蛋白HNRNPC与DDX58 mRNA的m6A位点结合，促进其成熟。而过表达ALKBH5可使C3H免疫小鼠肿瘤浸润淋巴细胞数量减少，IFNα可使其恢复。在HNSCC患者中，AKLBH5的上调与RIG-I和IFNα表达呈负相关。这些发现揭示了m6A修饰通过ALKBH5/RIG-I/IFNα轴介导的免疫微环境调节的新机制，为在HNSCC中靶向外转录组调节因子的治疗提供了理论基础。
云序生物m6A修饰研究五大模块
01 m6A RNA修饰测序
m6A RNA修饰测序（m6A-meRIP-seq）
对m6A RNA甲基化，目前最流行的检测手段为m6A-MeRIP-Seq技术，适用于m6A RNA甲基化谱研究，快速筛选m6A RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m6A测序：
- m6A 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
- m6A LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
- m6A Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
- m6A mRNA测序
- m6A miRNA测序
LC-MS/MS检测整体RNA修饰水平
精准高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
比色法检测整体RNA修饰水平
快速检测m6A整体甲基化水平
03 m6A RNA修饰上游酶的筛选m6A RNA修饰相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m6A RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m6A RNA修饰靶基因验证
MeRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
5.4 ChIP-seq
筛选或验证目标蛋白与DNA, 互作，研究相应的分子调控机制。
-- 云序生物服务优势 --
优势一：发表10分以上文章最多的m6A RNA甲基化测序服务平台。云序已累计支持客户发表71+篇高水平RNA修饰文章，合计影响因子570分+，是国内支持发文最多、累计影响因子最高的公司。
优势二：至今完成4000+例 m6A测序样本，全面覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：全面检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：独家提供m6A一站式服务：m6A整体水平检测、m6A测序、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down
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