单核苷酸多态性（SNP）在不同个体广泛存在，大部分研究者注重编码区的SNP，因为该位置直接导致氨基酸的变化引发功能差异，有趣的是，将近90％的与疾病相关的SNP位于蛋白质编码区域之外（45％内含子，43％基因间）1。有一类SNP较为特殊，即邻近外显子-内含子剪切位点，该类型往往导致前体mRNA的非正常剪切，而异常剪接在癌症中很常见，很多异常剪切可以认为是癌症的标志2。该类型的SNP可借助miniGene系统研究。那么什么是miniGene呢？
miniGene是在体外构建含有突变位点的部分外显子及内含子载体，转染细胞，运用RT-PCR及测序技术，分析基因变异对pre-mRNA序列的影响，适用于无突变细胞系，但突变点可能改变mRNA序列的情况。
突变之所以影响pre-mRNA剪切，是因为基因在内含子和外显子中均包含各种顺式作用元件，这是前体信使RNA（pre-mRNA）正确、有效的拼接所必需的。顺式元件主要包括：
5’and 3’剪切位点、内含子剪切增强子（ISE）、内含子剪切沉默子（ISE）、外显子剪切增强子 (ESE) 、 外显子剪切沉默子 (ESS)3，这些元件的突变就可能造成异常剪切，而最常见的是在外显子-内含子接头处位点的突变，如5’and 3’splice site的突变（典型的内含子两端为AG-exon-GT保守序列）。
剪切识别元件
不同于常规编码区导致单个氨基酸的改变，异常剪切引发mRNA一段序列的改变，常见的为：整个外显子缺失、部分外显子缺失、整个内含子保留（即内含子变为外显子）、部分内含子保留（即剪切发生在内含子上其他符合splice site特征的位点）、多个外显子缺失等。而这些异常剪切的结果是蛋白质缺失一长段氨基酸或者更为常见的翻译提前终止（插入、缺失的序列往往不是3的倍数），少部分SNP可能同时存在以上多个异常剪切类型。
异常剪切与疾病的发生密切相关，如TAU外显子10及其邻近内含子的突变，导致ESE遭到破坏，异常剪切导致了额颞叶痴呆4；肿瘤抑制基因BRCA2的突变与乳腺癌、卵巢癌有关，Velasco等人发现了20种的突变形式导致异常剪切，并与癌症的发生相关5。
BRCA2基因变异导致的异常剪切
构建示意图
载体构建示意图
miniGene实验流程
测序获得异常剪切的RNA序列
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【参考文献】
1.Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits
2.Aberrant RNA splicing in cancer; expression changes and driver mutations of splicing factor genes
3.Defective splicing, disease and therapy: searching for master checkpoints in exon definition
4.Minigene reporter for identification and analysis of cis elements and trans factors affecting pre-mRNA splicing
5.Functional classification of DNA variants by hybrid minigenes: Identification of 30 spliceogenic variants of BRCA2 exons 17 and 18