前言
距离全球首例猪心脏移植手术已经过去半年，“顶流”马里兰大学医学院Dr. Deqiang Li的研究团队于2022年7月在Circulation Research杂志上发表题目为“Epicardial HDAC3 promotes myocardial growth through a novel microRNA pathway”的心血管文章。该研究揭示了心脏发育中心外膜HDAC3通过抑制miR-322/miR-503来刺激Fgf9和Igf2进而促进致密心肌生长，为阐明先天性心脏缺陷的病因和促进心肌再生提供了新的策略和见解。
背景介绍
先天性心脏病CHD仍是世界范围内最常见的出生缺陷。肌源性缺陷常与多种形式的冠心病有关。既往的研究集中在确定心肌的内在因素来了解潜在的致病原因，而非心肌细胞的胞间通讯与调控作用被忽视。心外膜和心外膜衍生细胞能够通过旁分泌信号串扰调节相邻致密心肌组织的发育，又通过提供旁分泌生长因子（Fgf9、Igf2）在调节心脏再生中起着关键的枢纽作用。
HDAC（组蛋白去乙酰化酶）3是一类HDAC家族的成员，它可以催化从组蛋白尾部赖氨酸残基中去除乙酰基，并通过调节基因表达参与许多生物学过程。中胚层或全基因敲除HDAC3可导致肌源性缺陷和早期胚胎致死，心肌中特异性的HDAC3缺失却不会在早期心脏发育中对心脏形态表型产生影响，而是会损害出生后后期的心脏功能。这表明HDAC3在非肌细胞室间的功能可能对早期心肌发育至关重要。本研究旨在探寻早期心脏发育过程中，HDAC3在心外膜中的作用以及Fgf9和Igf2的表达如何受到HDACs或miRs的调控。
图. The schematics of the working model
亮点要素
1、发育中的心外膜中Hdac3的表达对致密心肌生长至关重要
2、HDAC3对于心外膜衍生的细胞分化和迁移是很重要的
3、miR-322和miR-503抑制Fgf9和Igf2的转录
4、HDAC3通过抑制miR-322和miR-503的表达来促进Fgf9和Igf2的转录
研究内容
01
研究者首先构建了心外膜特异性Hdac3敲除鼠Hdac3eko以研究心脏发育中Hdac3在心外膜中的潜在作用。对敲除Hdac3的心外膜进行了谱系追踪。发现E12.5-E16.5，epdc（心外膜衍生细胞）发生EMT迁移至致密心肌成为成纤维细胞和冠状动脉血管细胞。E14.5的eko心脏迁移至致密心肌的epdc比例显著降低，这表明在Hdac3缺乏的epdc中存在潜在的EMT迁移缺陷。心外膜促进胚胎冠状动脉发展，而eko心脏中冠状动脉血管细胞标志物Sox17阳性细胞明显减少，表明eko心脏中冠状动脉发育受损。心外膜和epdc通过胞间相互作用促进心肌致密化生长，研究者评估了胚胎期心外膜Hdac3缺陷心脏的心肌，E13.5/E14.5 eko心脏的致密层明显比对照心脏薄。又对细胞增殖/凋亡是否导致eko心室壁发育不良进行验证，E13.5 eko小鼠致密心肌中pH3/Brdu阳性心肌细胞的百分比与对照心肌相比显著降低，证明心脏发育中心外膜Hdac3特异性缺失导致心室壁发育不全。
Figure 1. Epicardial deletion of Hdac3 resulted in hypoplasia of ventricular compact wall.
02
为了进一步探究导致eko心脏室壁发育不全表型的潜在分子机制，研究者使用CRISPR/Cas9技术，构建了永生化小鼠心外膜细胞（MECs）Hdac3单克隆敲除株。Hdac3敲除MECs比对照MECs生长慢。又对细胞进行批量RNA测序和基因本体分析，发现了1681个下调基因。GO通路分析发现，前14个显著通路均参与细胞分裂。在分析下调基因中epdc分泌的生长因子后，确定Fgf9和Igf2是目标分子。验证发现Hdac3敲除株中Fgf9和Igf2在mRNA和蛋白水平上均降低。体内eko心脏中Fgf9和Igf2也显著降低。提示Fgf9和Igf2的表达下降与Hdac3缺失有关。
Figure 2. Hdac3 deletion resulted in downregulation of Fgf9 and Igf2.
03
研究者试图确定Fgf9和Igf2的减少是否与心肌细胞增殖减少有关。与对照细胞EV相比，Hdac3敲除株KO上清液中Fgf9和Igf2显著降低。又用细胞上清处理E13.5分离的原代胚胎心肌细胞。与EV上清相比，KO上清处理的pH3阳性心肌细胞百分比和心肌细胞总数显著降低并且其减弱了心肌细胞增殖下游信号通路ERK磷酸化的激活。而在KO中补充Fgf9和Igf2可以修复心肌细胞增殖缺陷并使p-FGFR1/p-IGFR1活化。以上结果表明，来自心外膜细胞分泌的Fgf9和Igf2提供了驱动心肌细胞增殖的重要线索。
Figure 3. Supplementation of Fgf9 or Igf2 rescues CM proliferation defects.
04
为了确定HDAC3是通过去乙酰化酶活性来诱导Fgf9和Igf2的表达，研究者用选择性HDAC3去乙酰化酶抑制剂RGFP966处理MECs，RGFP966处理显著降低了Fgf9和Igf2。研究者又进行了Rescue实验。慢病毒Hdac3在敲除株中重表达成功恢复了Fgf9和Igf2的表达，而去乙酰化酶失活突变慢病毒Hdac3的重表达并不能挽救Fgf9和Igf2的表达。证明HDAC3确实是通过去乙酰化酶活性调控Fgf9和Igf2的表达。
Figure 4. HDAC3 induces the expression of Fgf9 and Igf2 dependent on its deacetylase activity.
05
Fgfs和Igfs的表达可被miRs调控，研究者对敲除株进行了miR测序。通过差异表达分析及模拟结合位点筛选发现miR-322或miR-503模拟物处理显著抑制Fgf9和Igf2的表达。通过Western blot进一步验证了miR-322 mimics/miR-503 mimics处理对Fgf9和Igf2表达的显著抑制作用。又使用miR-322或miR-503模拟物处理培养的E13.5心肌细胞，显著降低了pH3阳性心肌细胞的百分比，表明miR-322和miR-503抑制心肌细胞增殖。当HDAC3的去乙酰化酶活性被RGFP966抑制时，miR-322和miR-503与敲除株中同样显著上调。体内E13.5 eko心脏中也观察到miR-322和miR-503的显著上调。证明了miR-322、miR-503能够抑制Fgf9、Igf2表达和心肌细胞增殖。
Figure 5.miR-322 and miR-503 repress the expression of Fgf9 and Igf2 and CM proliferation.
06
为了确定当Hdac3被敲除或抑制时，miR-322和miR-503的上调对Fgf9和Igf2的降低有因果影响，使用miRZip慢病毒干扰miR-322或miR-503的表达，敲低miR-322或miR-503后可显著恢复敲除株中Fgf9和Igf2的表达。以上结果表明HDAC3通过抑制miR-322和miR-503促进Fgf9和Igf2的表达。
Figure 6. Knockdown of miR-322 or miR-503 restores the expression of Fgf9 and Igf2.
07
H3K27Ac是活性启动子的标记，也是HDAC3的直接下游靶点。Hdac3缺失导致MECs中H3K27Ac显著增加。ENCODE实验发现，miR-322/miR-503的启动子区域受表观遗传调控。为了确定Hdac3缺失是否会影响miR-322/miR-503启动子的染色质可及性，研究者通过ChIP-qPCR研究了H3K27Ac在敲除株中的结合亲和力。发现Hdac3缺失显著增加了H3K27Ac与miR-322/miR-503启动子的结合，这表明Hdac3缺失使miR-322/miR-503启动子更容易被转录因子接近。为了明确这种染色质可及性的增加是否会影响miR-322/miR-503启动子的活性，又进行了miR-322/miR-503启动子荧光素酶报告基因实验。发现与对照细胞株相比，敲除株或经RGFP966处理后荧光素酶活性显著增加，表明HDAC3对miR-322/miR-503启动子的调控同样依赖于其去乙酰化酶活性。
Figure 7. HDAC3 represses miR-322/miR-503 promoter activity.
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