上一期我们给大家讲解了免疫荧光技术的样品制备流程和注意事项，这一期我们一起来学习一下免疫荧光技术的实验操作流程和技术细节。 下面，我们首先来看一下免疫荧光技术的操作流程：
免疫荧光技术流程
细胞间接免疫荧光-IF(ICC) 按合适的细胞密度接种细胞爬片 冷冻组织切片间接免疫荧光（IF-F） 1.制备好的冰冻切片放置于室温复温。 石蜡包埋组织切片间接免疫荧光（ IF-P ） 1.制备好的石蜡切片按以下顺序进行脱腊水化 直接免疫荧光 1. 4%多聚甲醛室温固定样品20 min，也可4℃固定过夜。 固定剂的选择 固定剂大体可分为两大类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如丙酮和乙醇能去除脂类物质使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上；交联剂一般通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。固定剂的选择没有通用规则，若未达到预期效果，可更换另一种固定剂。 1 通透 通透能够使抗体与胞内抗原相结合，其中包括抗原表位位于胞内端的跨膜蛋白，使用溶剂或去垢剂可实现通透化。若采用丙酮或甲醇固定，则可跳过。 2 封闭 用血清或蛋白封闭剂进行封闭是避免抗体与组织（某些易结合蛋白的物质）或 Fc 受体（结合抗体恒定区 (Fc) 的受体）非特异性结合的必要手段。理论上，对靶标表位没有亲和性结合的任何蛋白都可用于封闭。但事实上，某些蛋白更容易与非特异性位点相结合，因此他们更适合用于封闭。血清中包含可与非特异位点结合的抗体，是一种常用的封闭剂。推荐使用与二抗相同宿主的血清。当使用来自不同物种的二抗进行多重染色时，需要使用这些物种的血清共同封闭。 自发荧光的封闭 使用冰冻切片，降低固定过程中诱导自发荧光的可能性。 使用非醛类的固定剂。 用***钠或甘氨酸/赖氨酸处理组织，以此封闭固定过程中带来的醛基。 利用淬灭染料处理组织，例如滂胺天蓝/苏丹黑/台盼蓝或FITC封闭剂。 3 抗体染色 检测结果展示
1.弃去细胞培养液，PBS洗3次，5 min/次。
2.固定：4%多聚甲醛室温固定20 min，也可4℃固定过夜。
根据细胞室提供细胞的时间，若下午提供，那么当天不能完成实验，所以会在固定这步暂停，即4℃固定过夜；若上午提供细胞，当天可以完成全部实验，即室温固定20min。平时多数实验是室温固定20min。
3.PBS洗3次，5 min/次。
4.透膜：用含有0.3% Triton X -100的 PBS室温孵育20 min（如检测细胞膜外侧蛋白，可省略此步）。
5.PBS洗3次，5 min/次。
6.封闭：用PBS配制的5%~10%二抗来源相同种属正常血清室温封闭20 min。
7.PBS洗3次，3 min/次。
8.用Bioss标准抗体稀释液按合适比例稀释一抗，37℃下孵育2 h或4℃过夜（孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定）。
9.PBST洗3次，10 min/次。
10.用Bioss标准荧光抗体稀释液按合适比例稀释二抗，37℃下孵育1h （孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定） 。
11.PBST洗3次，10 min/次。
12.DAPI复染细胞核。
13.PBS洗3次，5 min/次。
14.取出细胞爬片置于载玻片上，镜下观察。
2.PBS洗3次，5 min/次。
3.封闭：用PBS配制的5%~10%二抗来源相同种属正常血清室温封闭20 min。
4.PBS洗3次，3 min/次。
5.用Bioss标准抗体稀释液按合适比例稀释一抗，37℃下孵育2 h或4℃过夜（孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定）。
6.PBST洗3次，10 min/次。
7.用Bioss标准荧光抗体稀释液按合适比例稀释二抗，37℃下孵育1h （孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定） 。
8.PBST洗3次，10 min/次。
9.DAPI复染细胞核。
10.PBS洗3次，5 min/次。
11.用防荧光淬灭封片剂封片，镜下观察。
二甲苯І：20min，二甲苯П：20min，二甲苯Ш：20min，无水乙醇：15min，95%乙醇：15min，70%乙醇：15min，50%乙醇：15min，蒸馏水І：5min，蒸馏水II：10min。
2.PBS洗3次，5 min/次。
3.抗原修复：0.01M枸橼酸修复液（依据抗原种类不同选择合适的抗原修复液与修复方式），沸水浴热修复15min。
4.PBS洗3次，5 min/次。
5.封闭：用PBS配制的5%~10%二抗来源相同种属正常血清室温封闭20 min。
6.PBS洗3次，3 min/次。
7.用Bioss标准抗体稀释液按合适比例稀释一抗，37℃下孵育2 h或4℃过夜（孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定）。
8.PBST洗3次，10 min/次。
9.用Bioss标准荧光抗体稀释液按合适比例稀释二抗，37℃下孵育1h （孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定） 。
10.PBST洗3次，10 min/次。
11.DAPI复染细胞核。
12.PBS洗3次，5 min/次。
13.用防荧光淬灭封片剂封片，镜下观察。
2.PBS洗3次，5 min/次。
3.封闭：用PBS配制的5%~10%二抗来源相同种属正常血清室温封闭20 min。
4.PBS洗3次，3 min/次。
5.用Bioss标准荧光抗体稀释液按合适比例稀释一抗，37℃下孵育2h或4℃过夜（孵育抗体的浓度、孵育时间通过预实验确定）。
6.PBST洗3次，10 min/次。
7.DAPI复染细胞核。
8.PBS洗3次，5 min/次。
9.用防荧光淬灭封片剂封片，镜下观察。
1.溶剂：可在用交联剂（如多聚甲醛）固定后使用。推荐用于细胞骨架、病毒和某些酶抗原。
2.去垢剂：包括能够破坏蛋白的作用剧烈的去垢剂（如 Triton X-100 或 Np-40）；也可以是不会溶解质膜的作用温和的去垢剂（如 Tween 20、皂素或洋地黄皂苷）。
自发荧光可由组织中存在的荧光化合物引起，例如黄素和卟啉。这些化合物会被用于固定、脱水切片的溶剂从组织中溶解，然而，其仍会存留在使用水性试剂处理的冰冻切片中；固定步骤也可能诱导自发荧光，在使用醛类固定剂时通常会发生这类情况，醛类固定剂会与胺类反应生成荧光产物。应进行检测以确保待研究的组织没有内在自发荧光或者固定步骤不会诱导自发荧光。
2. 孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37℃ 下1~2h，4℃下孵育过夜，注意4℃孵育后需要复温（防止切片从4℃直接放入PBS易脱片）。
3. 二抗一般室温或37℃ 30min~2h，具体时间需要摸索。
